Сверхэкспрессия

Когда сверхэкспрессия определяется как сильно увеличенная экспрессия гена в клетке . Это приводит к соответственно увеличению синтеза с белком , который является кодируемого этим геном .

Естественная сверхэкспрессия может происходить в ходе вирусной инфекции , в опухолях она может быть вызвана неправильной регуляцией генов или искусственно индуцированной в лаборатории генерации рекомбинантного белка с помощью вектора экспрессии .

Применение целевой сверхэкспрессии

Есть две области, в которых сверхэкспрессия может использоваться для получения рекомбинантного белка:

  • Сверхэкспрессия белка для последующей очистки и дальнейшего использования (здесь все еще можно провести различие между экономическими процессами и процессами, которые должны генерировать небольшое количество белка для исследовательских целей)
  • Сверхэкспрессия для анализа белка и его свойств, а также влияния на производственный организм

При чрезмерном аналитическом выражении меньше внимания уделяется экономической эффективности процесса. Оптимизация производства отсутствует, но, как правило, используются проверенные и проверенные коммерчески доступные стандартные системы. Высококлассный, т.е. ЧАС. Увеличение суммы не предусмотрено.

Когда производственные процессы установлены, часто проводится обширная оптимизация сверхэкспрессии, чтобы получить максимально стабильный и продуктивный процесс. Различные параметры меняются на генетическом и технологическом уровне, чтобы в конечном итоге получить максимально возможное количество продукта.

Прокариоты

Наиболее распространенной формой сверхэкспрессии белка у прокариот является использование плазмидных векторов . Здесь кассета экспрессии устанавливается на плазмиде (локализация), трансформируется в организм и стабилизируется там в течение периода культивирования. Преимущество этого метода заключается в генетически простом способе работы и высокой дозе гена, которая достигается за счет количества копий плазмиды.

Другой метод сверхэкспрессии у прокариот - это геномное включение кассет сверхэкспрессии. Для сверхэкспрессии должна быть выбрана либо сильная промоторная система, возможно, в сочетании с модификациями, стабилизирующими РНК, либо высокая доза гена должна быть достигнута за счет множественной интеграции кассеты в геном.

Также возможно локализовать гены сверхэкспрессии в геномах фагов. Затем систему экспрессии заражают генетически модифицированными фагами. Когда фаг берет на себя метаболизм бактерии, целевой ген также экспрессируется в большей степени.

Эукариоты

Гены также сверхэкспрессируются у эукариот . Это можно сделать как в культуре клеток, так и во всем организме. Кассеты временной или интегрированной в геном экспрессии используются для сверхэкспрессии во всем организме. В качестве промоторов использовали промотор CMV и промотор CAG . Плазмиды также используются для экспрессии в культуре клеток. В этом случае в клетке производится большое количество бактериальной плазмидной ДНК, содержащей вставленную соответствующую кассету экспрессии . Однако плазмиды не могут реплицироваться в эукариотических клетках и поэтому через некоторое время теряются. Этот метод часто используется в исследовательских целях для характеристики эффекта сверхэкспрессии на клетку. Штаммы-продуценты обычно создаются путем геномной интеграции кассеты.

Бесклеточная экспрессия

Бесклеточный белковый синтез основан на получении клеточных лизатов с плазмидами или мРНКом , которые смешивают и затем бесклеточный ( в пробирке для получения кодированного белка - мишени). Этот метод все еще относительно неэффективен. Подходит для производства высокотоксичных продуктов.

Различные типы выражения

У сверхэкспрессии есть два основных способа выражения:

  • непрерывное выражение
  • индуцированное выражение

При непрерывной экспрессии ген непрерывно экспрессируется через конститутивный промотор, и соответствующий белок накапливается в клетке.

В индуцированной экспрессии используется индуцибельный промотор. Экспрессия целевого гена индуцируется, то есть активируется индуктором. Этот метод популярен, когда избыточная экспрессия оказывает негативное влияние на производственный организм. Причиной тому может быть высокая нагрузка на метаболические ресурсы в фазе роста. Следствием этого является более медленный рост и, следовательно, более длительное время работы биореактора и, как следствие, увеличение производственных затрат, особенно в промышленных процессах. Индуцированная экспрессия в продуктах, токсичных для клеток, также полезна. Здесь после индукции экспрессии происходит самоотравление и гибель клетки. Что касается рентабельности производственного процесса, поэтому делаются попытки разделить процесс на фазу роста и фазу производства. Наибольшее возможное количество биомассы образуется в фазе роста, а целевой белок затем продуцируется в фазе продуцирования путем индукции промотора. Таким образом, максимальное количество продукта получается до того, как клетки отмирают, что делает процесс значительно более экономичным.

Распространенные системы сверхэкспрессии

Наиболее часто используемой системой для сверхэкспрессии рекомбинантных белков является грамотрицательная бактерия E. coli . Однако в настоящее время используются различные другие организмы, такие как грамположительные Bacillus megaterium , коринебактерии и дрожжи . Экспрессия в эукариот необходимо для различных белков, поэтому различные культуры клеток линии , такие как животных клеточных линий (например , Sf9 клетки, клетки СНО , клетки Vero или клеток НЕК ) используются. Некоторые белки также производятся в генетически модифицированных организмах, таких как растения, в процессе фарминга . Целые организмы высших эукариот, такие как козы или крупный рогатый скот , также используются реже .

Нацеленная сверхэкспрессия посредством индукции субстрата в E. coli

Нацеленная сверхэкспрессия белков в клетках модельных организмов (например, E. coli ) с помощью трансгенов - это возможность в биологических и медицинских исследованиях производить большее количество (несколько мг ) белка для использования его функции или в дальнейших экспериментах. Изучите структуру . Распространенным методом является сверхэкспрессия трансгена, транскрипция которого регулируется бактериальным lac-опероном .

Векторы

Чаще всего используются векторы на основе плазмиды pBR322 , адаптированные с помощью векторной конструкции , такие как плазмиды pUC или векторы pET.

индукция

Наиболее широко используемой системой для индукции промоторов является lac-оперон E. coli . Лактоза или IPTG используются в качестве индуктора. Но системы с арабинозой (см. Систему pBAD) или рамнозой (см. E. coli KRX) в качестве индуктора также широко распространены. Система для физической индукции представляет собой, например, систему промотора индуцированного температурой холодового шока на основе промотора cspA E. coli от Takara.

Промоутеры

Выбор коммерческих систем с разными промоторами относительно велик. Используются оба природных промотора, такие как промотор Т7 или промотор bla, а также синтетические промоторы и гибридные промоторы, такие как промотор tac, гибрид промоторов trp и lac из генома E. coli .

Генетические требования

Трансген находится вне бактериального генома на плазмиде . Перед тем, как начинается собственно кодирующая область, то есть перед трансгеном, находится оператор lac-оперона ( lacO ). Плазмида также содержит ген lacI , который кодирует lac-репрессор LacI. LacI связывает оператора lacO перед трансгеном и блокирует его промотор , предотвращая, таким образом, экспрессию трансгена и, таким образом, избыточную продукцию кодируемого белка.

Индукция субстрата IPTG

IPTG , молекула, очень похожая на аллолактозу , связывает репрессор, расположенный на операторе перед трансгеном. Это изменяет конформацию репрессора, он больше не может связывать ДНК и освобождает оператора. Это делает промотор доступным для РНК-полимеразы . Их связывание с промотором инициирует транскрипцию ДНК в мРНК .

Подходящие промоторы для сверхэкспрессии

Высвобождения одного только промотора для инициации транскрипции недостаточно для образования очень больших количеств белка. Для этого должны быть доступны большие количества мРНК, а это означает, что транскрипция должна быть очень эффективной. Требуются сильные промоторы, которые вовлекают РНК-полимеразы в промотор в быстрой последовательности и позволяют так же быстро начинать транскрипцию. Примеры включают промотор Т7 из одноименного бактериофага или промотор tac , гибрид промоторов trp и lac из генома E. coli . Однако для промотора Т7 соответствующая РНК-полимераза Т7 также должна присутствовать в геноме системы экспрессии .

литература

  • Джозеф Сэмбрук , Дэвид В. Рассел: молекулярное клонирование. Лабораторное руководство. Том 3. 3-е издание. Пресса лаборатории Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, 2001, ISBN 0-87969-576-5 .

Индивидуальные доказательства

  1. ↑ Марк Крутс и др. а .: Нулевые мутации в програнулине вызывают убиквитин-положительную лобно-височную деменцию, связанную с хромосомой 17q21. В кн . : Природа. 442, стр. 920-924 (24 августа 2006 г.) DOI : 10.1038 / nature05017 .
  2. ↑ Ma Y, Ghoshdastider U, Wang J, Ye W, DötschV, Filipek S, Bernhard F, Wang X: Внеклеточная экспрессия человеческой глюкозамин 6-фосфат N-ацетилтрансферазы (HsGNA1) для скрининга ингибиторов. . В: Protein Expres Purif . 86, No. 2, 2012, pp. 120-126. DOI : 10.1016 / j.pep.2012.09.011 . PMID 23036358 .
  3. ↑ C. Roos, L. Kai, S. Haberstock, D. Proverbio, U. Ghoshdastider, Y. Ma, S. Filipek, X. Wang, V. Dötsch, F. Bernhard: бесклеточное производство мембран на высоком уровне Белки с нанодисками . В кн . : Методы молекулярной биологии . 1118, 2014, с. 109-30. DOI : 10.1007 / 978-1-62703-782-2_7 . PMID 24395412 .
  4. ↑ Roos, L Kai, D Proverbio, U Ghoshdastider, S. Filipek, V Dötsch, F Bernhard: Ко-трансляционная ассоциация внеклеточных экспрессируемых мембранных белков с поставляемыми липидными бислоями . В кн . : Биология молекулярных мембран . 30, № 1, 2013, с. 75-89. DOI : 10.3109 / 09687688.2012.693212 . PMID 22716775 .
  5. ↑ DA Mead, E. Szczesna-Skorupa, B. Kemper: Одноцепочечные ДНК-плазмиды «голубого» промотора T7: универсальная тандемная промоторная система для клонирования и белковой инженерии. В: Белковая инженерия. 1986 год, № 1. С. 67-74.
  6. ↑ HA de Boer, LJ Comstock, M. Vasser: Промотор tac: функциональный гибрид, полученный из промоторов trp и lac. В: Известия Национальной академии наук . № 80, 1983, стр. 21-25.
  7. ^ Веб-сайт промоутерских систем T7 от Sigma-Aldrich, доступ 29 мая 2011 г.