Электрофорез

Электрофорез с фрагментами ДНК, полученными с помощью ПЦР ;
(1) отец,
(2) ребенок,
(3) мать.

Электрофорез (устаревший катафорез ) описывает миграцию заряженных коллоидных частиц или растворенных молекул под действием электрического поля .

Пионером электрофореза был Арне Тизелиус (1937). Прорыв произошел после того, как Оливер Смитис в 1955 году обнаружил, что крахмальные гели очень подходят для электрофореза (позже, например, в значительной степени заменены акриламидом).

описание

Скорость дрейфа (также «миграция скорость ») от коллоидных частиц, обычно белков или нуклеиновых кислот, является пропорционально к напряженности поля и заряду ионов в электрофорезе , обратно пропорционален радиусу частиц и вязкость вещества. Кроме того, важную роль играет ионная среда раствора, в которой протекает электрический ток. Физической причиной движения является сила сдвига в двойном электрическом слое, который окружает коллоид ( двойной слой звезды ) и заставляет заряженную жидкость двигаться относительно макромолекулы. В гель-электрофорезе соотношение между радиусом частицы и размером пор геля, используемого в качестве среды-носителя, также играет роль, потому что гель действует как молекулярное сито , так что больший радиус частицы оказывает более сильное ингибирующее влияние на скорость миграции, чем можно было бы ожидать от одной только вязкости. . Из-за разного заряда иона и радиуса частиц отдельные вещества (молекулы) движутся с разной скоростью через материал-носитель и достигают разделения в соответствии с их электрофоретической подвижностью . Это делает электрофорез очень подходящим для разделения смесей веществ (особенно смесей молекул). В качестве материала носителя могут использоваться жидкости, гели (см. Гель-электрофорез , в основном с полиакриламидом или агарозой ) или твердые вещества . ${\ displaystyle v}$ ${\ displaystyle E}$ ${\ displaystyle Q}$${\ displaystyle r}$ ${\ displaystyle \ eta}$

Гели агарозы в основном используются для разделения фрагментов ДНК, тогда как белки в основном разделяются в полиакриламидных гелях . Для белков используются методы SDS-PAGE и вестерн-блоттинг . Белки имеют цвиттерионы с дополнительными зарядами детергента, такого как додецилсульфат натрия ( англ. Додецилсульфат натрия , SDS), загружаются с разделением в соответствии с плотностями гетерогенного заряда с разделением в соответствии с будущей молекулярной массой . Путем добавления SDS и кипячения ( денатурирования ) белки адсорбируют алифатический конец отрицательно заряженного лаурилсульфата натрия пропорционально своей длине в развернутом виде (а также пропорционально молекулярной массе). Около 1,4 грамма SDS связывается на грамм белка в однопроцентных растворах SDS. Отрицательно заряженные сульфатные группы молекул SDS отталкиваются друг от друга, что способствует разворачиванию (линеаризации) белков при условии, что белок не имеет дисульфидных мостиков. Поэтому при определении молярной массы добавляются восстановители для превращения дисульфидов в тиолы . Поскольку несколько сотен отрицательно заряженных молекул SDS связываются с молекулами белка, внутренним зарядом белков при основном pH геля можно пренебречь.

Электрофоретическая подвижность

Два геля SDS после окончания проб и окрашивания полос белка кумасси

Электрофоретическая подвижность двух разделяемых частиц должна быть различной, чтобы добиться разделения посредством электрофореза. Электрофоретическая подвижность - это сумма многих физических факторов, которые в конечном итоге влияют на скорость миграции частицы во время электрофореза. Общая движущая сила, которая вызывает движение частиц, - это сила, которая действует на частицу с определенным зарядом в электрическом поле с заданной напряженностью . ${\ displaystyle F}$${\ displaystyle q}$${\ displaystyle E}$

${\ Displaystyle F = q \ cdot E}$

Этому противодействует сила, которая является результатом вязкости и размера частицы (идеализирована для сферических частиц :) и может быть рассчитана в соответствии с законом Стокса . ${\ displaystyle \ eta}$${\ Displaystyle 6 \ cdot \ pi \ cdot r}$

${\ Displaystyle F = 6 \ cdot \ pi \ cdot r \ cdot \ eta \ cdot v}$

Теоретическая электрофоретическая подвижность является результатом этих двух уравнений . Теоретически по той причине, что эти два уравнения применимы только к идеализированному состоянию без носителей заряда с бесконечно разбавленными (практически бессолевыми, что, однако, противоречит принципу электрофореза, поскольку ионы соли требуются в качестве мобильных носителей заряда) электролитами . Также предполагается, что ускоряющая сила соответствует силе трения, и поэтому преобладает постоянная скорость миграции . Следовательно, подвижность ионов в этой модели такова: ${\ displaystyle \ mu _ {е, p} ^ {0}}$

${\ displaystyle \ mu _ {e, p} ^ {0} = {\ frac {v} {E}} = {\ frac {q} {6 \ cdot \ pi \ cdot r \ cdot \ eta}}}$

В реальных системах существует дополнительные факторы , такие как трение между гидратными оболочками ( электрофоретический эффектом ), деформация распределения заряда в качестве релаксации в электрическом поле ( диссипативный эффекта см ионной атмосферы ), то степень по диссоциации в электролите и эффектах от материала - носителя ( молекулярного сита , электроосмос и Адсорбционные эффекты ) износиться.

В то время как традиционные теории предполагают, что электрофоретическая активность частицы требует чистого заряда частицы, новые результаты моделирования молекулярной динамики предполагают, что из-за молекулярной структуры воды на поверхности даже незаряженные частицы могут проявлять электрофоретическую активность.

Оффорд эмпирически нашел следующую зависимость между подвижностью и чистым зарядом и молярной массой:${\ displaystyle Z}$

${\ displaystyle \ mu = {\ frac {Z} {M ^ {2/3}}}}$

тепло

Максимальное напряжение, которое может быть приложено, ограничено нагреванием геля, которое вызывается эффектами трения мигрирующих молекул. Тепло может привести к неравномерной миграции молекул, увеличению диффузии (что приводит к размытым полосам) и денатурировать молекулы . Выделение тепла определяется приложенным напряжением и электрической проводимостью используемой системы, в частности проводимостью электрофорезного буфера .

виды

• Аффинный электрофорез
• Электрофорез в агарозном геле
  • SDD-AGE
• Электрофорез в градиенте плотности ( электрофорез без носителей)
• Прерывистый электрофорез
• Электроосмос возникает в электрофоретических процессах.
• Электрофокусировка
• Электрофорез в свободном потоке
• Гель-электрофорез
  • 2D гель-электрофорез (двумерный электрофорез)
• Градиентный электрофорез
• Диэлектрофорез
• Иммуноэлектрофорез
• Изоэлектрическая фокусировка возникает в электрофоретических процессах.
• Капиллярная электрохроматография
• Капиллярный электрофорез
• Липидный электрофорез
• Вестерн-блоттинг
• Изотахофорез
• Электрофорез в полиакриламидном геле
  • BAC-PAGE
  • CTAB-PAGE
  • Родная страница
  • QPNC-PAGE
  • SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в SDS)
• Гель-электрофорез в импульсном поле
• Электрофорез сыворотки
• Миграционный электрофорез
• Зональный электрофорез

применение

Электрофорез в основном используется как аналитический метод в биологии и медицине. Наиболее важные приложения включают электрофорез сыворотки , а также анализ ДНК в виде фрагментов и секвенирование ДНК. Здесь возможность используется для отделения друг от друга молекул разной длины. Для определения измеренных значений геля, такого как Используется специализированное программное обеспечение для оценки, например, ширины, молярной массы, количественной оценки или нормализации. Электрофорез также является основой для разделения белков и высокотехнологичных процессов протеомного исследования. График результатов представляет собой электрофореграмму . В дополнение к аналитическим методам, методы препаративного электрофореза (включая электрофорез в свободном потоке ) используются для получения очищенных белков в миллиграммах .

Другие технические приложения:

• Электронная бумага
• Катодная окраска погружением
• Электрофильтрация

сказка

Электрофоретические эффекты были впервые исследованы в 1807 году Петром Ивановичем Страхов и Фердинандом Фридрихом фон Рейсс . Электрофорез был разработан в 1937 году Тиселиус в качестве способа , с которой коллоиды в жидком носителе , может быть отделен в электрическом поле ( английский подвижной границы электрофорез , электрофорез с движущимся пограничным слоем ). За это Тизелиус получил Нобелевскую премию по химии в 1948 году . В 1940-х годах твердые фазы все чаще использовались для лучшего разделения ( английский зонный электрофорез , зональный электрофорез), такие как гель крахмала от Оливера Смитиса или фильтровальная бумага . Поскольку они имеют тенденцию к микробному разложению , также использовались другие гидрогели , например Б. агароза или полиакриламид . Если в 1950-х годах радиальный электрофорез часто проводился на круглых дисках ( английский радиальный электрофорез , дисковый электрофорез), сегодня используются почти исключительно прямоугольные гели ( английский пластинчатый гель-электрофорез , гель-электрофорез на пластинке).

литература

• Манфред Х. Гей: Инструментальная аналитика и биоанализ . 3. Издание. Springer, Берлин / Гейдельберг 2015, ISBN 978-3-662-46254-6 , Глава 8: Электрофорез , DOI : 10.1007 / 978-3-662-46255-3_8 . 
• Р. Э. Оффорд: Электрофоретическая подвижность пептидов на бумаге и их использование в определении амидных групп. В кн . : Природа. Volume 211, Number 5049, август 1966 г., стр. 591-593. PMID 5968723 .

Индивидуальные доказательства

1. ↑ Запись по электрофорезу . В: Сборник химической терминологии ИЮПАК («Золотая книга») . DOI : 10.1351 / goldbook.E02022 .
2. ↑ В. Кнехт, Х. Дж. Рисселада, А. Э. Марк, С. Дж. Марринк: Электрофоретическая подвижность не всегда отражает заряд на капле масла . В: Journal of Colloid and Interface Science . лента 318 , нет. 2 , 15 января 2008 г., стр. 477-486 , DOI : 10.1016 / j.jcis.2007.10.035 ( PDF [доступ к 5 января 2010]). 
3. ↑ Рейнхард Кун: Капиллярный электрофорез: принципы и практика. Springer Science & Business Media, 2013, ISBN 978-3-642-78058-5 , стр. 80.
4. ^ Рейсс, FF: Sur ООН Nouvel ДЕЙСТВИТЕЛЬНО де l'Электрисите galvanique . В: Mémoires de la Société Impériale des Naturalistes de Moscou . лента II , 1809, стр. 327-337 . 
5. ↑ Арне Тизелиус: Новый аппарат для электрофоретического анализа коллоидных смесей . В: Труды общества Фарадея . лента 33 , 1937, стр. 524-531 , DOI : 10.1039 / TF9373300524 . 
6. ↑ О. Смитис: Зональный электрофорез в крахмальных гелях: групповые вариации белков сыворотки здоровых взрослых людей . В кн . : Биохим. J. Band 61 , нет. 4 , 1955, стр. 629-641 , PMID 13276348 , PMC 1215845 (полный текст).